Differenziamento delle linee reporter di iPSC in neuroni dopaminergici.
Nelle prime fasi di questo progetto i partner BioRep e CNR avevano portato avanti attività in stretta collaborazione, per il trasferimento delle competenze di manipolazione e coltura delle cellule pluripotenti e dei loro derivati.
In questa fase più recente le attività sono proseguite nei laboratori BioRep, adattando i protocolli testati in laboratorio a condizioni che permettessero una successiva industrializzazione.
Come primo passaggio necessario per ottenere uno stock di IPS, BioRep ha messo in coltura ed espanso alcune linee IPS a diversi passaggi: 2 cloni di controllo (DIGI) e 2 cloni mutati (OPA1).
In seguito, si è proseguito quindi con il differenziamento delle cellule da iPS a NPC.
Allo scopo di standardizzare il più possibile il processo per renderlo riproducibile a livello di produzione, è stato testato un primo protocollo che prevedeva l’utilizzo di un kit commerciale specifico per il differenziamento delle iPS in NPC.
I progenitori ottenuti con questo kit, sebbene cresciuti più rapidamente di quelli prodotti con il protocollo di laboratorio, hanno però sempre mostrato una morfologia molto eterogenea.
Controllo di qualità dei campioni cellulari validazione funzionale delle cellule differenziate e non, ottenute secondo i procedimenti standardizzati.
Come già osservato, le cellule prodotte con questo protocollo sono risultate fenotipicamente poco omogenee, utilizzabili per test farmacologici, ma inadatte ai test elettrofisiologici: in generale si è quindi valutato il kit come non appropriato per la generazione di progenitori che possano dare origine a neuroni dopaminergici.
Si è quindi deciso di rivalutare il protocollo in uso presso l’istituto di Neuroscienze del CNR, già utilizzato in precedenza nel corso del technology transfer.
Il protocollo, eseguito questa volta internamente a BioRep con la supervisione del personale del CNR, ha permesso di ottenere stock di progenitori più omogenei.
I partner hanno scelto di creare gli stock da DIGI clone #68 e OPA1 clone #78.
Il Capofila Axxam ha testato la vitalità cellulare, il potenziale proliferativo dei progenitori e la loro risposta funzionale in termini di citotossicità (per mimare uno stress cellulare presente in Parkinson) e risposta ad agenti ossidanti.
Creazione e mantenimento di una bio-banca e di catalogo online.
Gli NPC ottenuti con questo protocollo sono stati distribuiti ad Axxam e Università Vita-Salute San Raffaele.
UniSR ha valutato positivamente le cellule di OPA1, mentre ha riscontrato una ripresa lenta del controllo la ridotta velocità di crescita sembra essere un problema correlato alla linea cellulare, in quanto si osserva anche nei progenitori prodotti al CNR, nonché nelle iPS di partenza.
Per il controllo di qualità dei campioni cellulari e la validazione funzionale delle cellule differenziate e non, ottenute secondo i procedimenti standardizzati, una delle vial prodotte per ogni clone, sia di iPS sia di NPC, è stata scongelata per controllare vitalità e capacità di crescita (velocità di duplicazione), dopo congelamento e scongelamento (freezing-recovery).
Per quanto riguarda la freezing-recovery, per le iPS (non essendo possibile la conta vitale) la valutazione è fatta su osservazione in piastra: non risultano problemi tranne nel caso di uno specifico clone che risulta poco vitale anche prima del congelamento, e ha una velocità di duplicazione intrinsecamente bassa.
Sempre per quanto riguarda il recupero della vitalità, i risultati sono tutti positivi per gli NPC, con vitalità e velocità di crescita elevate (tranne nel caso del clone menzionato).
Per la validazione funzionale, sugli stock di iPS e NPC è stata messa a punto la caratterizzazione mediante immunofluorescenza.
Il set-up del protocollo è consistito nello screening delle concentrazioni dei vari anticorpi, per ottenere la sensibilità e la specificità necessarie al rilevamento delle proteine caratteristiche dei tipi cellulari esaminati.
Il test in immunofluorescenza ha permesso la ricerca e la quantificazione dei marcatori di staminalità, differenziamento e proliferazione.
È stata inoltre monitorata l’espressione di Nestina all’aumentare del numero dei passaggi, sia nel controllo sia nel mutato. Il controllo mostra una ridotta espressione di Nestina dopo il passaggio 8, mentre il mutato dopo il passaggio 6, indicando un inizio di differenziamento (o perdita di caratteristiche di progenitore neuronale).
Programmi e lavori in corso: a partire da questi progenitori si sta procedendo con lo sviluppo e validazione di una piattaforma di screening.
Inoltre, verranno ripetute le prove di congelamento di neuroni allo scopo di ottenere, dopo lo scongelamento, neuroni vitali e allestire quindi stock di neuroni, oltre che di iPS e NPC.
Questi Neuroni saranno utilizzati nel WP5 come validazione della piattaforma.
Per NPC i marcatori dosati sono stati Nestina (marcatore di proliferazione delle cellule progenitrici del sistema nervoso centrale) e Ki67 (proteina nucleare strettamente associata con la proliferazione cellulare).
Le proteine trovate sono state quelle attese, a dimostrazione del mantenimento della pluripotenza per le iPS, e dell’inizio del differenziamento e della proliferazione per NPC.
Dopo questo numero di passaggi, la proliferazione rallenta (diminuisce quindi anche la produzione di ki67), e il fenotipo si fa lasso.
Un’ulteriore nota: gli NPC prodotti con il protocollo CNR hanno mostrato una maggiore espressione di Nestina.
Programmi e lavori in corso: a partire da questi progenitori si sta procedendo con l’attività prevista nei task 4.1, 4.2 e successivamente nel WP5.
Inoltre, verranno ripetute le prove di congelamento di neuroni allo scopo di ottenere, dopo lo scongelamento, neuroni vitali e allestire quindi stock di neuroni, oltre che di iPS e NPC. Questi Neuroni saranno utilizzati nel WP5 come validazione della piattaforma.
